当前的COVID-19疫情极大地加速了mRNA技术在我们现实世界中的应用，在这场战斗中，mRNA证明了它与传统生物制药和疫苗技术相比的独特优势。为了克服人体生理环境中mRNA的不稳定性，mRNA的纳米递送系统是其体内应用的关键因素之一。纳米递送系统包括脂质递送系统（脂质纳米颗粒和脂质体）、聚合物复合物、胶束、阳离子肽等。总而言之，mRNA的应用范围很广，它的时代才刚刚开始。

一、 为什么需要纳米递送系统？

核酸的分子量比较大（104-106 Da）并且带有负电荷，因此很难通过细胞的阴离子脂质双层膜，此外，由于mRNA是单链大分子，较为脆弱，细胞外的存在也会限制mRNA的传递，例如被先天免疫系统中的吞噬细胞所吞噬或者被核酸酶降解，都会导致靶细胞摄取效率低，体内释放不成功等问题。电穿孔、基因枪以及离体转染可以向培养皿中的细胞递送mRNA，然而，在实际人体中递送时，则需要纳米递送系统，用以避免毒性以及不必要的免疫原性。

幸运的是，为了实现mRNA的有效递送已经开发了许多基于材料的创新解决方案。目前最常用的纳米递送系统包括脂质纳米颗粒（LNPs）、脂质体、脂质复合物、高分子聚合物、胶束、多肽、鱼精蛋白、电穿孔等。LNPs和脂质体是最有前途的mRNA递送工具之一。

二、 纳米递送系统

图1.mRNA的递送系统及应用

2.1 脂质纳米颗粒（LNPs）

图2.LNP结构示意图

LNPs目前是基因治疗的主要非病毒递送载体。随着LNP介导的siRNA治疗剂Onpattro® (patisiran)获批上市，mRNA递送领域最先想到的就是采用LNPs递送。 如图所示：LNPs是一种具有磷脂单层结构的生物相容性载体，可以将mRNA包裹在核中以避免降解。除了带负电荷的mRNA外，LNP通常还有其他四种成分：可电离的阳离子脂质、中性辅助磷脂、胆固醇和PEG化脂质。

中性辅助磷脂一般为饱和磷脂，可提高整体相变温度和稳定性。

胆固醇具有很强的膜融合能力，促进细胞内mRNA的摄入和细胞质的进入。

PEG化脂质位于其表面以提高其亲水性，避免被免疫系统快速清除，防止颗粒聚集，增加稳定性。

可电离的阳离子脂质，它是mRNA递送和转染效率的决定性因素。它需要在生理条件下（pH≈7.0）非电离，但在酸性条件下电离（pH=5.0）。此时叔胺头部质子化，形成离子化头部和疏水链尾部，进而形成锥形结构，促进内涵体/溶酶体膜向六方晶相转变，实现高效递送和转染。羧酸酯的存在保证了阳离子脂质在体内的可降解性，避免了脂质聚集带来的毒副作用。

LNP可通过快速混合进行制备，目前主流的方法是通过微流体制备，将含有mRNA的乙醇溶液添加到过量的水中，然后与脂质迅速混合，自组装包裹mRNA后形成纳米颗粒。

目前上市的两款mRNA新冠疫苗使用的就是LNP递送mRNA。

表1.两款mRNA新冠疫苗LNP组分对比

除了上述两款上市mRNA新冠疫苗中的两款LNP，还有许多新型LNP在研发阶段且极具价值。不同的材料对LNP的性质有很大的影响。

l Aguado课题组开发了四种具有不同成分的LNP用于mRNA递送，并且通过对比，DOTAP作为阳离子脂质表现出较高的稳定性，并且伴随着多糖的加入而提高了稳定性。

表2.不同配方的四种LNP

图3.三种阳离子结构

l Davies课题组则发现，发现皮下注射含有mRNA的LNP时，可以在血浆中产生可测量的分泌蛋白，但会受到相关炎症因子的影响。 为了克服这一局限，构建了由MC3阳离子脂质和L608阳离子脂质组成的LNPs，其蛋白表达持续时间延长，可实现慢性病治疗性蛋白的系统水平稳定。

图4.MC3和L608阳离子脂质结构

l Billingsley课题组研究了靶向治疗嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）的疗效，该疗法具有诱导急性淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤患者缓解的能力。然而，使用病毒载体可以诱导永久性的CAR表达，这可能会导致严重的不良反应。因此为了降低不良反应的毒性，他们设计了LNP用作mRNA体外递送到人体T细胞中，并从24个可溶性脂质库中发现7种能增强疗效缓解症状的LNP。

图5.A烷基链；B筛选库；C合成反应

除此以外，还有更多课题组致力于LNP的研发，不同的LNP具有不同的靶向和效果，甚至有课题组设计研发出可雾化的脂质纳米颗粒，用于肺部的疾病治疗。

虽然LNP是mRNA递送的最有效手段之一，但存在几乎无穷无尽的设计空间，需要耗费大量人力物力及时间成本对其进行修改，以实现高效，无毒的靶向特定组织，器官或细胞的LNP制剂。此外，稳定性差使得mRNA-LNP的运输和储存成本很高。它的长期存储也是发展mRNA-LNP体系需要重点考虑的问题之一。

2.2 脂质体

脂质体是由磷脂双层形成的球形封闭囊泡。脂质体由A. D. Bangham于1965年首次发现，并长期用于小分子药物递送，粒径范围为20nm至1000nm。除了小分子化疗药物的封装外，越来越多的研究集中在基因药物（包括mRNA，pDNA，siRNA等），蛋白质药物，激素药物等脂质体的封装和递送能力上。阳离子脂质体带正电荷，主要由阳离子脂质组成，阳离子脂质能够以靶向方式有效地浓缩核酸。此外，通过改变阳离子脂质体的物理和化学性质，例如调整粒径的大小和修饰阳离子脂质体的表面，可以在体内获得良好的药代动力学性质。一般来说，脂质体的制备方法包括薄膜分散法、溶剂注射法、冷冻干燥法、pH梯度法等

图6.阳离子脂质体包封mRNA的结构示意图

目前用于制备脂质体的材料众多，包含特殊的阳离子脂质，磷脂以及实现脂质体隐形的PEG化脂质。

表3.用于mRNA递送的脂质体常用材料

通过脂质体递送mRNA有许多优点。首先，脂质体是球形囊泡，可以封装mRNA并抵抗核酸酶。其次，脂质体与细胞膜相似，易于与受体细胞融合，转染效率高。第三，作为一种递送系统，脂质体不受宿主限制。最后，磷脂双层膜结构高度模拟细胞膜。它是生物进化理论中已知的稳定结构，具有优异的长期储存稳定性。

l Miche课题组通过薄膜分散法制备阳离子脂质体，并包封mRNA。脂质体由DC-CHOL / DOPE组成，该制剂即使在室温下储存80 d仍可以保持稳定。

l Kuznetsova课题组利用三苯基膦，采用非共价手段修饰后DPPC脂质体。与十四烷基咪唑烃尾表面活性剂相比，脂质体可以维持4个月以上的稳定性。

l Mai课题组通过薄膜分散法制备了由DOTAP/CHOL/DSPES-PEG组成的阳离子脂质体。将脂质体，mRNA和鱼精蛋白以10：1：1的比例混合，形成了稳定的脂质体/鱼精蛋白-mRNA复合物。通过鼻腔给药，该脂质体核酸药物显示出极大的效率和刺激树突状细胞成熟的能力，并可以进一步诱导强烈的抗肿瘤免疫反应。

l Zhang R课题组用胆固醇修饰的阳离子多肽DP7对DOTAP脂质体进行了修饰。修饰后的DOTAP脂质体具有了跨膜结构和免疫辅助功能，同时也提高了个性化新抗原mRNA递送的效率，并增强了激活树突状细胞（DC）的能力。

l Huang H课题组首先利用脂质体包裹了编码RBD区域的mRNA，该mRNA脂质体复合物可以在体内表达RBD并成功诱导接种小鼠产生针对SARS-CoV-2的特异性抗体，有效的中和了SARS-CoV-2假型病毒。

然而，尽管mRNA已经成功地通过脂质体递送，但脂质体也有一些缺点。与LNP相比，脂质体制备和mRNA包封的生产过程要复杂得多。一般来说，LNP和脂质体都是脂质纳米颗粒。它们有许多相似之处，也有很大的不同之处。

表4.LNP和Liposome异同之处

2.3 聚合物复合物

高分子量聚合物材料（分子量10-106）化合物，通常是通过简单结构单元之间的共价键反复连接形成叫高分子量的复合物，例如壳聚糖，聚乙烯亚胺，聚氨酯等。大多数用于mRNA递送的聚合物材料需要通过修饰以提高其转染效率和稳定性。聚乙烯亚胺（PEI）系统成功地将mRNA递送到细胞和鼻腔内。

l Soliman课题组通过静电络合作用制备了含有mRNA的纳米颗粒，其由不同程度的脱乙酰化和磺化高分子组成。结果表明，通过调节透明质酸和壳聚糖的聚合物长度和电荷密度，直接影响了与mRNA的亲和力及其转染效率

l Choia课题组则报道了一种mRNA递送系统，该系统采用的是氧化石墨烯（GO）-聚乙烯亚胺（PEI）复合物。研究发现GO-PEI复合物对于mRNA的有效负载以及保护mRNA免受核酸酶的降解非常有效。GO-PEI/RNA复合物处理细胞的动态悬浮培养显著提高了重编程效率。

l Chiper课题组通过化学修饰伯胺到芳香族结构域，制备了1.8 kDa的聚乙烯亚胺（PEI）颗粒。这种修饰不仅不会影响聚乙烯亚胺的缓冲能力，还可以增强其pH敏感聚集，稳定细胞外复合物，同时仍然允许核酸进入细胞后有效释放。

图7. Chiper课题组化学修饰PEI的化学结构

2.4 胶束

胶束是指在表面活性剂浓度达到水溶液中一定值后开始大量形成的有序分子聚集体。在胶束中，表面活性剂分子的疏水基团聚集形成胶束的核心，亲水极性基团形成胶束的外层。

l Roloff 课题组研究了一种新型RNA聚合物两亲性分子组装成球形胶束，直径约为15-30nm，研究证明它们可以在不使用转染试剂的情况下有效地进入活细胞。

图8. Roloff 课题组研发的胶束

l Chan课题组则提出使用专门定制的多链氨基酸将mRNA静脉递送到小鼠的大脑中。这种结构最终将凝结成一个介于24至34nm之间的多链纳米。然后，荧光素酶（Luc2）的mRNA作为报告基因通过体外转录（IVT）并随后通过脑室内（ICV）注射将多链氨基酸注入小鼠大脑以绕过血脑屏障（BBB）。研究显示，多重链纳米结构表现出较好的mRNA递送效率，并且没有显著的免疫应答记录，可应用于脑部疾病的治疗。

2.5 阳离子多肽

基于多肽的递送是一种较少被探索的系统，目前只有鱼精蛋白（CureVac的狂犬疫苗）在临床试验中被评估。新的递送方法包括使用阳离子细胞穿透肽（CPP）和阴离子肽。CPPs系统已被证明可以改善体内T细胞免疫反应，调节先天免疫反应，并在体外增强DC和人癌细胞中的蛋白质表达。与阴离子肽偶联的mRNA多链体在DC细胞中表现出细胞摄取的增加而不诱导细胞毒性。

图9. 多肽递送系统示意图

鉴于mRNA的巨大应用潜力，随着越来越多关于mRNA纳米递送系统研究的开展，势必会有更多转染效率更强、毒性更低、稳定性更好的新型递送载体。

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核酸递送路漫漫，一路都有AVT相伴。

Reference：

[1]. Li M, Li Y, Li S, Jia L, Wang H, Li M, Deng J, Zhu A, Ma L, Li W, Yu P, Zhu T. The nano delivery systems and applications of mRNA. Eur J Med Chem. 2022 Jan 5;227:113910. doi: 10.1016/j.ejmech.2021.113910. Epub 2021 Oct 8. PMID: 34689071; PMCID: PMC8497955.