mRNA的特异性递送是质粒DNA的绝佳替代品，因为后者具有随机整合到宿主基因组中的潜在风险。随着mRNA修饰技术和递送技术的发展，其应用前景越来越广阔。

一、 感染性疾病

mRNA疫苗可以同时激活细胞和体液免疫两种机制，达到高保护率。mRNA疫苗的研究对象是具有强传染性和高危害性的RNA病毒，如严重急性呼吸系统综合征（SARS-CoV-2）、甲型流感病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、寨卡病毒（Zika）、人类免疫缺陷病毒（HIV-1）、埃博拉病毒（EBOV）等。

 

1.1 新冠疫苗

近几十年来，mRNA疫苗的发展和技术突破，为它在SARS-CoV-2大流行期间的迅速崛起奠定了基础。SARS-CoV-2是一种新型的β-冠状病毒。SARS-CoV-2在其（+）RNA基因组中至少编码29种蛋白质，其中四种是结构蛋白质：刺突（S），膜（M），包膜（E）和核衣壳（N）蛋白。SARS-Cov-2病毒体主要由膜（M）蛋白和包膜（E）蛋白组成的包膜，内部包载单链阳性RNA病毒以及核衣壳（N）蛋白。表面的刺突（S）蛋白负责感染宿主细胞，这也是中和抗体的主要位点，容易发生突变，而mRNA疫苗可以通过根据突变菌株的突变基因更新其序列来快速应用。治疗性mRNA进入细胞质后，可被翻译成S蛋白，进而诱导免疫应答。同时，mRNA疫苗还利用人体自身的分子机制，体内制造抗原缩短了免疫反应时间。

 

图1.COVID-19病毒样貌图

图2.mRNA疫苗作用机制

COVID-19在世界范围内造成了一场充满挑战和威胁性的大流行，造成了巨大的健康和经济损失。FDA已授予BNT162b2（辉瑞/BioNTech）和mRNA-1273（Moderna）的紧急使用授权。它们都是由LNP包裹编码S蛋白的mRNA制备而来。BNT162b2已被推荐用于16岁及以上的人，剂量为30μg，在预防SARS-COV-2感染方面有效率为95%。mRNA-1273则被推荐给18岁及以上的人，剂量为100μg，预防SARS-CoV2感染方面有效率为94.5%。然而，两种疫苗均报告了一些相关的过敏症状，包括注射部位的疼痛、发红、发热、疲劳、头痛和肌肉疼痛。据报道，与mRNA-1273相比，BNT162b2的不良反应发生率较低；然而，mRNA-1273在运输和储存方面更稳定。

 

图3.两款mRNA疫苗研发时间线

1.2 流感疫苗

Martinon课题组证明了通过对动物进行皮下注射mRNA脂质体疫苗，可以在动物体内诱导产生细胞毒性T淋巴细胞灭杀流感病毒。流感疫苗是第一个尝试使用mRNA技术进行预防疾病的疫苗。

Petsch课题组设计了多价mRNA疫苗，在动物体内评估了疫苗预防甲型流感（H1N1），H3N2和H5N1病毒的作用。这种皮内注射的mRNA疫苗可诱导产生特异性中和抗体，并保护动物免受甲型流感病毒的侵害。

除此以外，Moderna通过肌内注射针对甲型禽流感病毒H10N8和H7N9的mRNA疫苗已被证明是安全和有效的。

1.3 狂犬病疫苗

mRNA疫苗的保护作用已被证明在呼吸道病原体之外依旧是有用的。目前CureVac已经在其狂犬病疫苗候选产品CV7202的I期试验中，评估了该疫苗的安全性，反应性和免疫反应。值得一提的是，起初CureVac的一代狂犬病疫苗CV7201采用的递送载体是鱼精蛋白，但是由于其转染效率并不是很好，所以二代苗改为使用LNP进行递送。

Lou课题组则发现，使用LNP递送自编码狂犬病病毒糖蛋白（RVG）的扩增mRNA可以对狂犬病病毒起到一个良好的保护作用。他们比较了几种常用的阳离子脂质，然后选择了DOTAP以及DDA，它们在诱导抗原表达方面最有效，后续将使用动物实验进一步评估由它们形成的LNP-mRNA的疫苗效果。

1.4 Zika病毒疫苗

Pardi课题组提出了一种二价mRNA疫苗，该疫苗使用的是在2013年爆发中编码寨卡病毒株的前叶和包膜糖蛋白的mRNA。单剂疫苗，封装在LNP中并通过皮内递送，疫苗接种后两周至五个月内，可以保护小鼠免受病毒的攻击。

Moderna也使用了相同的抗原，通过包封未修饰mRNA开发了一种针对寨卡病毒的疫苗-mRNA-1893疫苗，该疫苗获得了FDA的快速批准，并正在进行I期试验，以评估其安全性、耐受性和免疫原性。研究也证实：mRNA-1893可以在感染的小鼠模型成功阻止病毒的传播。

1.5 CMV疫苗

John课题组设计了一种巨细胞病毒（CMV）疫苗，用于预防怀孕期间和移植患者的CMV感染。该疫苗由六种编码CMV糖蛋白和五聚体复合物，经过修饰的mRNA组成，并以LNP的形式肌内注射。单剂量注射后，在小鼠和非人灵长类动物中引起了强烈的免疫反应，目前正处于由Moderna（mRNA-1647）赞助的临床试验中。

1.6 基孔肯雅热疫苗

除了增强主动免疫外，mRNA还可用于被动免疫。Moderna的候选药物mRNA-1944旨在提供针对基孔肯雅热病毒的被动保护。从自然感染幸存者的B细胞中分离出超强效抗体，其序列被编码成mRNA分子，封装在LNP中，并通过输注递送进小鼠体内。在基孔肯雅热小鼠模型中递送mRNA-1944后，评估其保护能力。对非人灵长类动物的进一步研究也表明，mRNA-1944具有持久的免疫原性作用。

1.7 新生儿疱疹

Latourette II课题组选择在交配前的雌性小鼠进行免疫来评估mRNA-LNP和蛋白质疫苗对新生儿疱疹的保护作用，然后比较了母体和幼鼠中的中和抗体水平。这两种疫苗都保护了第一胎和第二胎免受播散性感染，并被证明可有效预防新生儿疱疹。

二、 肿瘤

mRNA肿瘤疫苗的目的是强化细胞介导的免疫反应，例如典型的T淋巴细胞反应，从而达到在不伤害正常细胞的情况下，去除或减少肿瘤细胞的目的。STING被认为是先天免疫和适应性免疫调节因子的中心。当受到刺激时，STING会诱导I型干扰素。细胞因子和T细胞募集因子的表达导致巨噬细胞的天然效应细胞树突状细胞（如NK）和肿瘤特异性T细胞，它们不仅可以在体内表达抗原，还可以激活STING信号通路，并显着增强肿瘤抗原特异性免疫应答。这也意味着mRNA疫苗可以与其他肿瘤学疗法（如检查点抑制剂和免疫激动剂）联合使用，以实现更全面的肿瘤学治疗效果。

Moderna，BioNtech和CureVac是致力于mRNA技术的三巨头，在mRNA肿瘤疫苗上投入了大量资金。几种mRNA肿瘤疫苗目前正在临床试验中。

mRNA-5671靶向KRAS，目前正在NSCLC，结直肠癌以及胰腺癌中，具有晚期或转移性KRAS突变的患者中进行评估。

mRNA-4157是Moderna的另一种癌症疫苗，但与mRNA-5671不同，它是黑色素瘤的个体化治疗疫苗。在这种方法中，对患者的肿瘤进行基因测序和生物信息学分析，以鉴定20个患者特异性新抗原表位，这些表位由为个体患者制造的mRNA结构编码。

BNT122（II期）旨在治疗局部晚期或转移性实体瘤，包括黑色素瘤，非小细胞肺癌和膀胱癌。BioNtech还有许多其他抗肿瘤疫苗正在开发中，例如用于晚期黑色素瘤的BNT111，BNT112用于治疗针对前列腺癌，BNT114用于三阴性乳腺癌，BNT115用于卵巢癌等。BNT113是抗HPV16衍生的癌蛋白E6和E7，它们存在于HPV16阳性的实体癌中，例如头颈部鳞状细胞癌。

表1. mRNA三巨头的肿瘤候选疫苗研发

公司	候选产品	治疗领域
Moderna	mRNA-4157	个性化肿瘤疫苗
	mRNA-5671、mRNA-2416、mRNA-2752	结直肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌
BioNTech	BNT111	晚期黑色素瘤
	BNT112	前列腺癌和高危局限性前列腺癌
	BNT113	HPV16阳性实体癌
	BNT114	三阴性乳腺癌
	BNT115	卵巢癌
	BNT122	黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌等
CureVac	-	非小细胞肺癌
	-	浅表性肿瘤

除上表中的疫苗情况，阳离子脂质体在mRNA肿瘤疫苗中得到了广泛的研究，尤其是已在多种肿瘤中进行了临床前研究。

表2.用于肿瘤候选疫苗中的脂质

脂质组成	疾病
DOTAP	肠癌
DOTAP/CHOL/DSPE-PEG	肺癌
DOTAP/CHOL/DSPE-PEG	肿瘤

mRNA疫苗将一些外源性基因表达产物直接作用于免疫细胞，促进免疫细胞的生长和增殖。因此可以通过增强T细胞的抗原反应来增强宿主的抗病毒和抗肿瘤作用。

三、 心血管疾病

越来越多的研究表明，RNA在靶向以前参与心血管疾病发展和进展的途径方面具有很高的实用性。尽管在治疗方案方面取得了重大进展，但心血管疾病仍然是世界头号死因。

Mipomersen是最早治疗心血管疾病的核酸疗法之一，它是一种寡核酸（ASO）药物，靶向编码载脂蛋白B-100的mRNA。经过化学修饰的ASO可以减少其毒性。在最近一项ASO针对脂蛋白mRNA的II期试验中，超过90%的患者在每周注射20mg或每4周注射60mg后，脂蛋白（a）的浓度低于50mg/dl。

另一个已经进入临床试验的ASO是volanesorsen。该ASO可以皮下注射，并通过结合APOC3 mRNA并促进其降解来发挥作用。在一项II期研究中，Volanesorsen降低了Apoc-II（-80%）和甘油三酯（-71%），HDL-胆固醇水平升高（46%）。降低胆固醇的另一种方法是靶向编码酶前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/酮（PCSK9）的mRNA，该酶主要在肝脏中产生。

除了抑制内源性mRNA的药物外，第一种进入临床试验的心血管相关mRNA药物是Moderna设计研发的编码血管内皮生长因子（VEGF）-A的mRNA。在一项I期研究中，皮内注射VEGF-A mRNA可导致2型糖尿病患者局部VEGF-A蛋白表达增加（经皮肤微透析评估）和皮肤血流量增加。根据这些结果，一项2a期临床试验将确定该mRNA治疗药物是否能恢复冠状动脉疾病患者缺血但可行的心肌区域，如射血分数评估。这是一项随机、双盲、安慰剂对照、多中心研究，针对接受冠状动脉搭桥手术的中度收缩功能受损患者。通过心外膜注射将患者随机分配到枸橼酸盐缓冲液中的0mg，3mg或30mg VEGF-A mRNA剂量。如果这项计划工作成功，它将提供证据，证明将mRNA直接注射到缺血组织中可以改善灌注和功能。

 

图3.moderna与阿斯利康合作共研的心肌缺血药物

四、 其他疾病

4.1 遗传性疾病

Patel课题组使用了微流控技术制备了11个脂质纳米颗粒，并测试了它们将mRNA递送到眼球后部的能力。研究表明，含有低pKa和不饱和脂质链的LNP，在视网膜中具有最多的基因转染剂量，并且基因表达动力学显示，mRNA快速启动（在4小时内）并且可以持续96小时。眼部的基因递送具有细胞类型特异性，在视网膜色素上皮（RPE）中表达最多，在神经胶质细胞中表达有限，实验也表明，通过LNP递送mRNA可用于治疗RPE的单基因视网膜退行性疾病并预防失明。

4.2 免疫系统不成熟

Riley课题组研究了在子宫内使用LNP来克服由于胎儿体积小而导致的免疫系统不成熟。他们开发了一个LNP库，用于将mRNA递送到子宫内的小鼠胎儿。利用LNP递送荧光素酶mRNA进行了筛选，并且与具有更高效率和安全性的基准递送系统相比，LNP可以在胎儿肝脏，肺和肠道中积累，表明LNP可以递送mRNA以诱导肝脏产生治疗性分泌蛋白。

4.3 神经系统疾病

Dhaliwal课题组开发了一种基于mRNA疗法的阳离子脂质体，用于治疗慢性疾病，其中脂质体由DOTAP，DPPC和胆固醇组成。评估了小鼠模型中，鼻内传递到大脑的潜力。结果证明了特异性非病毒mRNA递送至脑部并治疗各种神经系统疾病中的可行性

4.4 推进iPSC技术

安全诱导多能干细胞（iPSCs）的生产为再生疗法的发展带来了巨大的希望。Choi课题组利用GO-PEI复合物将mRNA高效递送到脂肪组织衍生的成纤维细胞中，并成功开发了一种基于RNA的简单iPSC生产技术。研究证实：基于GO-PEI递送mRNA的iPSC生产技术可用于制备临床安全且经济上可行的iPSC，从而推动iPSC技术向临床环境的转化。

4.5 体内CAR-T细胞编辑

CAR-T疗法就是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，英文全称Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。

2022年1月7日，Science期刊封面文章形式刊登了宾夕法尼亚大学研究者的最新研究，利用LNP为媒介靶向T细胞递送mRNA，直接在体内构建CAR-T治疗小鼠心衰症状。

研究者将编码表达FAP CAR的mRNA通过LNP包裹并经CD5抗体介导靶向递送至T细胞。CD5介导内吞到T细胞后，mRNA释放并在T细胞膜表达FAP CAR，从而完成体内构建CAR-T的过程。mRNA注射至小鼠体内后，随后mRNA分子被T细胞捕获，使得T细胞获得特异性靶向攻击心肌成纤维细胞的能力。mRNA成功重编码心衰小鼠的T细胞，导致心脏纤维化明显减少，心脏的大小与功能也修复至接近正常的状态。这种方式有效改善了心衰小鼠模型的心脏功能。

 

图4. LNP递送mRNA实现CAR-T细胞的体内生成

五、 展望

合成的mRNA在递送到细胞质后经历瞬时蛋白表达，可以通过生理代谢途径完全降解，这可以避免基因组整合的风险。这种瞬态特征满足了许多仅需要蛋白质表达有限时间的应用的需求，例如基因编辑，细胞重编程和一些免疫疗法。不同的mRNA递送系统具有不同的递送机制。以脂质纳米递送系统为例，LNPs通过微流体制备方法将mRNA捕获在核心中，并且主要通过内吞作用，溶酶体逃逸途径递送到细胞中。除脂质纳米递送系统外，其他纳米递送系统还具有自己的mRNA包埋策略和递送特征，如聚合物复合物、胶束、阳离子肽等。然而，基于合成mRNA的疗法也存在一些缺点，例如递送效率低下和不稳定等问题。目前，受纳米递送系统有限的内体逃逸的阻碍，只有少量的mRNA（0.01%）可以成功进入细胞质并表达蛋白质，当然随着自复制mRNA的引用，剂量问题势必得到改善。同时，在不久的将来，冻干或其他药物处理方法可能有助于解决这些问题，甚至能够进行鼻腔、口服或呼吸给药。mRNA纳米递送系统的给药途径对于确定mRNA疫苗在体内的代谢和靶抗原蛋白的翻译效率非常重要。目前，mRNA疫苗是系统的或局部施用的，这取决于需要表达抗原蛋白的位置。预防性疫苗通常局部皮下和肌肉注射以诱导强烈的免疫反应，而治疗性mRNA疫苗通常腹膜内或静脉内给药。此外，创新的多功能材料可能是应对mRNA应用挑战的另一种解决方案。

综上所述，COVID-19大流行将mRNA技术推向了世界，在关键时刻显示出其独特的优势。这些技术是经过学术界和工业界科学家多年艰苦努力而开发的。虽然并不完美，但不可否认的是，mRNA疗法已经准备好迎接它的闪耀时代，并向全面工业革命的过渡。

 

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[1]. Li M, Li Y, Li S, Jia L, Wang H, Li M, Deng J, Zhu A, Ma L, Li W, Yu P, Zhu T. The nano delivery systems and applications of mRNA. Eur J Med Chem. 2022 Jan 5;227:113910. doi: 10.1016/j.ejmech.2021.113910. Epub 2021 Oct 8. PMID: 34689071; PMCID: PMC8497955.