此前，tyc122cc太阳成集团产品团队通过多期软文与视频，分析了生物系统中缓冲盐的重要作用，特定制剂（如mRNA-LNP）中缓冲液的筛选考量，并简要介绍了缓冲盐在冷冻/冻干状态下pH值变化趋势的相关研究。

本期，tyc122cc太阳成集团产品团队延续这一话题，对应用较广的缓冲体系之一——磷酸盐缓冲体系（PBS）进行深入分析。

在与众多业内专业人员沟通过程中，很多人反馈磷酸盐缓冲体系用于冷冻或冻干剂型时稳定性结果不佳，怀疑可能存在比较剧烈的pH改变。

为此，tyc122cc太阳成集团产品团队进行了文献调研，本期通过分享一篇来自美国明尼苏达大学药学院研究者的论文，探讨磷酸盐缓冲液(PBS)冷冻状态下pH的变化情况、原因以及应对策略。

01 介绍

磷酸盐缓冲液(PBS)被较广用作冷冻保存和生物药物的开发生产中，也被用于冻干生物制剂和诊断试剂。

PBS(通常称为PBS 1X)缓冲液含有氯化钠(137 mM)、磷酸氢二钠(8.1 mM)、氯化钾(2.7 mM)和磷酸二氢二钾(1.5 mM)。

当磷酸盐溶液冷却时，磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)的结晶会导致冷冻浓缩物的pH值发生明显的变化。如果在PBS溶液冷却时观察到类似的pH值变化，则可能对生物制剂的稳定性产生不利影响。

02 冷冻PBS溶液的表征

（1）低温pH值测量

当PBS溶液从20℃冷却到-25℃时，pH值变化约4.3个单位(图1a)。根据先前对磷酸钠缓冲液(由磷酸和磷酸氢二钠组成)的研究，这种pH值的变化是由于十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)结晶所致。由于PBS中含有NaCl和KCl，因此确定这些盐对缓冲溶液相行为的影响是很有意义的。

将only含有氯化钾或氯化钠其中一种盐的磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二氢钾)溶液冷却，并测量pH值(图1c、d)，均检测到pH值变化。

单独的磷酸缓冲溶液，即不添加盐，也表现出了接近PBS溶液的pH位移(~ 3.8个单位)(图1b)。

图1 四种溶液冷冻50分钟，随后在-25℃保持冷冻，测量其pH(右y轴，红色曲线)和温度(左y轴，黑色曲线)的变化情况；(a) PBS溶液，(b)磷酸钠缓冲液(浓度与PBS中相同)，(c)磷酸钠缓冲液+氯化钠(浓度与PBS中相同)，(d)磷酸钠缓冲液+氯化钾(浓度与PBS中相同)。

（2）低温XRD（X射线衍射）

将PBS溶液从室温冷却至-40℃，在预定温度下记录XRD图谱(图2a)。在-15℃时，冰和磷酸氢二钠明显结晶。

在低温pH测量中观察到，在-15℃左右时pH值明显下降，这是由于磷酸氢二钠的选择性结晶(图1)。氯化钠和氯化钾的结晶分别在-25℃和-35℃左右时观察到。没有发现磷酸二氢钾结晶的证据。因此，十二水合磷酸氢二钠、二水合氯化钠和氯化钾依次从PBS溶液结晶。

当冷冻PBS溶液从-40℃加热到室温时，氯化钾(-23℃)和二水合氯化钠(-21℃)的峰依次消失(图2b)。即使在-5℃时，也可以观察到十二水磷酸氢二钠的峰(图2b)。

图2 冷冻PBS水溶液的XRD图谱。将溶液从室温冷却到-40℃，然后加热到-5℃(冷却和加热速度均为1℃/min)。(a)在0、-5、-10、-15、-21、-23、-25、-35和-40℃下的冷却和(b)在-40、-35、-25、-23、-21、-15、-10和-5℃下的加热过程中记录的XRD图谱叠加。

（3）冷冻PBS的热力学分析

在冷冻PBS的DSC加热曲线上观察到三个吸热峰，在-24.3℃和-22.1℃有两个重叠的吸热峰(图3)。

在-24.3℃时的吸热可归因于氯化钠-氯化钾-冰共晶的熔化。二水合氯化钠-冰共晶在-22.1℃发生熔化。如前所述，XRD通过氯化钾(−23℃)和氯化钠二水合物(−21℃)峰的消失提供了支持证据(图2b)。较后，在-0.3℃下观察冰融化吸热。

图3 冷冻PBS溶液的DSC加热曲线。将溶液以5℃/min的速度从室温冷却至-60℃，保持10 min，然后以1℃/min的速度加热至室温。只显示了较终的加热曲线。插图显示了两个共晶熔化峰的重叠。

03 含共溶溶质（海藻糖，甘露醇）的冷冻PBS溶液的表征

（1）低温pH值测量

海藻糖(5% w/v, 146 mM)或甘露醇(1% w/v, 55 mM)的加入导致PBS中pH值变化幅度突出降低。海藻糖存在时为1.6个单位(图4a)，甘露醇存在时为1.7个单位(图4b)。

图4 冷冻50分钟，随后在-25℃保持冷冻的pH(右y轴)和温度(左y轴)的变化情况；(a)含有海藻糖(5% w/v)的PBS，(b)含有甘露醇(1%w/v)的PBS。

（2）低温XRD

当含有海藻糖(5% w/v)的PBS溶液冷冻至-40℃，然后加热至-5℃时，只有冰结晶，没有缓冲盐结晶的证据(图5)。

图5 含海藻糖(5% w/v)的冷冻PBS水溶液的XRD图谱。将溶液从室温冷却到-40℃，然后加热到-5℃(冷却和加热速度均为1℃/min)。(a)0、-5、-10、-15、-21、-23、-25、-35和-40℃下冷却时记录的XRD图谱叠加，以及(b)在-40、-35、-25、-23、-21、-15、-10和-5℃下加热时记录的XRD图谱叠加。

当含有甘露醇(1% w/v)的PBS溶液冷却时，在-35℃下观察到十二水合磷酸氢二钠和二水合氯化钠的结晶(图6a)。在没有甘露醇的情况下，缓冲盐在-15℃时首先明显结晶(图2a)。因此，在甘露醇的存在下，缓冲盐的结晶被较大延迟。此外，十二水磷酸氢二钠峰的强度要低得多。该结果为甘露醇对磷酸氢二钠结晶的抑制作用提供了直接证据。

甘露醇还能抑制氯化钠的结晶。甘露醇存在时二水合氯化钠峰的强度远小于不存在甘露醇时的强度。PBS中其他溶质的结晶，即氯化钾和磷酸钾没有观察到，也没有甘露醇结晶的证据。

当冷冻溶液加热时，二水合氯化钠的峰在-25℃时消失(图6b)，这与DSC中观察到的二水合氯化钠-冰共晶熔化温度(-25.2℃)接近。由于在冷却过程中没有氯化钾结晶的证据，因此可以合理假设甘露醇抑制了KCl的结晶。如果冷冻浓缩物中保留了氯化钾，则不会形成二水合氯化钠-氯化钾-水三元体系。甘露醇完全抑制二水氯化钠-氯化钾-水三元共晶，部分抑制二水氯化钠-水三元共晶。在进一步加热冷冻溶液后，无水α-和β-甘露醇以及半水合甘露醇在-15℃下结晶(图6b)。

较后，甘露醇峰在−2℃时消失，这与甘露醇共晶熔化温度−1.5℃非常吻合。十二水磷酸氢二钠峰在-1℃时消失(图6b)，再次与十二水磷酸氢二钠-水共晶熔融温度(-0.5℃)非常吻合。

图6 含甘露醇 (1% w/v)PBS冷冻水溶液的XRD谱图。将溶液从室温冷却至-40℃，然后加热至0℃(冷却和加热速率均为1℃/min)，并在几个选定的温度下收集冷却和加热过程中的XRD图谱。(A)冷却和(B)加热时记录的XRD图谱叠加图。

（3）热力学分析

当冷冻溶液被加热时，共晶熔化被抑制，甘露醇部分抑制，海藻糖完全抑制（见下表3）。

总体而言，添加海藻糖(5% w/v)可以完全抑制PBS的氯化钠结晶，而添加甘露醇(1% w/v)可以部分抑制PBS的氯化钠结晶。由于冷冻过程中的共晶结晶会导致细胞损伤，在冷冻保存中，使用海藻糖等添加剂提供了完全抑制盐结晶的途径。

04 冻干产物的特征

当PBS被冷冻干燥时，较终的冻干产物显示出归因于氯化钠、无水磷酸氢二钠和氯化钾的峰(图7)。在冷冻溶液中，氯化钠和磷酸氢二钠已经结晶为水合物。在干燥过程中，它们转化为各自的无水结晶形式。

PBS与甘露醇(1% w/v)冷冻干燥得到结晶甘露醇(α-和β-形式)，以及氯化钠、无水磷酸氢二钠和氯化钾(图7)。更早的时候，在冷冻溶液中，观察到甘露醇的一部分是半水合物(图6b)。干燥过程中完成了半水到无水的过渡。

海藻糖抑制了体系中所有溶质的结晶。所有溶质在较终的冻干产物中都保持无定形。这一观察结果与磷酸盐+海藻糖溶液冻干后得到的结果一致。

图7 PBS溶液、含甘露醇(1% w/v)的PBS和含海藻糖(5% w/v)的PBS冻干得到的粉末XRD谱图。鉴定了磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、α-甘露醇和β-甘露醇的特征峰。

05 重要性

当磷酸盐缓冲溶液（PBS）冷却时，其中一种缓冲成分的选择性结晶会在部分冷冻的溶液中引起明显的pH值变化。鉴于PBS在生物医药、细胞保存和诊断制剂中的较广使用，这一信息具有巨大的实际重要性。

缓冲溶液的目标是在一个狭窄的范围内维持pH值。因此，观察到的盐结晶和随之产生的pH值变化，可能对系统中活性成分的稳定性产生不利影响。

该研究通过测量pH值和监测溶液中结晶的相来表征缓冲盐在冷冻PBS溶液中的结晶，分析了PBS在海藻糖和甘露醇这两种常用辅料存在下的冷冻行为。

单独的PBS溶液在冷冻时，表现出明显的pH值变化(3~4个单位)，PBS中加入结晶(甘露醇)或非结晶(海藻糖)溶质后，pH值变化幅度明显降低(pH值变化only为~ 1.7个单位)。因此，这些辅料提供了一种抑制冷冻PBS溶液pH值变化的途径。

海藻糖的存在抑制了二水合物氯化钠-水共晶的结晶。这可能有利于低温保存，因为细胞损伤与共晶结晶有关。

06 冷冻或冻干制剂中使用PBS的考量

基于该研究，在冷却过程中，PBS的pH值明显降低(~4.3单位)。在PBS中加入海藻糖或甘露醇作为溶质，将pH值的变化幅度降低到~1.7个单位。甘露醇部分抑制PBS组分的结晶，而海藻糖可以抑制PBS体系中所有溶质的结晶。

那么，对于某个具体的冷冻或冻干剂型的制剂，是否可以选用PBS作为缓冲体系呢？

笔者认为可以按照以下步骤进行考量：

①prescription筛选阶段，比较PBS与其他候选缓冲体系，测量换用不同缓冲体系时，制剂prescription在冷冻状态下的pH变化值

②结合已上市制剂prescription信息与筛选实验结果，评估活性成分（如抗体蛋白，mRNA-LNP）在该pH变化幅度下的长期稳定性

③若pH变化突出影响制剂中活性成分稳定性，建议弃用PBS，换用其他生物缓冲体系（如组氨酸，Tris，HEPES等）

④若影响在可接受范围内，出于生产或审批或其他因素倾向于选择PBS，建议制剂prescription中选用海藻糖作为低温保护剂，抑制PBS冷冻时的溶质结晶，提升制剂稳定性。