目前已有超过 40% 获得市场批准的单克隆抗体在其配方中添加了组氨酸和盐酸组氨酸，在基于蛋白质的生物制剂配方中，常用的组氨酸浓度范围为10 mM~20 mM，已知的最低使用浓度为3 mM（bamlanivimab，pH 6.0），最高使用浓度可达50 mM（Takhzyro™，pH 6.0，Entyvio®，pH 6.3）[1]。

组氨酸的结构可分为三个主要部分（见图1）：α-羧基（pKa 1.8）、α-氨基（pKa 9.2）和咪唑侧链（pKa 6.0）。咪唑基团是一种很强的亲核基团，能够快速提供与接受质子，在中性环境中，组氨酸不带电，表现出疏水特性，而当pH< pKa 时，组氨酸质子化带正电，转变为亲水性分子。

在基于蛋白质的生物制剂中，组氨酸通常起到pH调节剂、蛋白质稳定剂、抗氧化剂、降粘剂及增溶剂的作用：

溶液pH会通过改变氨基酸侧链的电荷状态、破坏或形成非共价相互作用、甚至引发共价修饰等方式对氨基酸残基的化学完整性以及蛋白质高级结构的折叠等多种性质产生深远影响，缓冲液可用于控制溶液的 pH值。为了获得更好的缓冲效果，缓冲液的pH值应控制在缓冲剂 pKa 值的1个pH单位范围内。组氨酸的 pKa 约为 6.0，能够使组氨酸缓冲液的pH值保持在5.5至6.5之间。然而，由于配方中存在其他辅料，组氨酸实际的缓冲范围更更宽（pH 5.0 ~6.9）。在实际生产过程中，组氨酸常与盐酸组氨酸共同发挥作用，如表1所示，部分获批抗体制剂配方中，组氨酸与盐酸组氨酸总是成对出现。

组氨酸还可以直接作为多种基于蛋白质的生物制剂配方的良好稳定剂。蛋白质的物理稳定性包括构象稳定性、胶体稳定性和界面稳定性。辅料的添加通常会对蛋白质的稳定性产生不止一种影响。与其他缓冲剂相比，组氨酸有助于提高构象稳定性和胶体稳定性，维系构象稳定性的主要机制为配体结合。如图2所示，在浓度、pH值和离子强度完全相同的情况下，组氨酸对干扰素τ制剂的构象稳定作用优于其他缓冲液（如磷酸盐和Tris）[2]。

胶体稳定性涉及蛋白质-蛋白质相互作用，其中蛋白质作为典型的胶体，分子间产生净吸引力或排斥力，因此，胶体稳定性影响蛋白质聚集的倾向。研究表明，组氨酸稳定性的机制与缓冲液分子遮蔽蛋白质表面暴露于溶剂中的疏水区域有关。

此外，组氨酸能通过与其他残基形成氢键，阻止抗体铰链区的裂解，在相同的pH 值和离子强度条件下，与磷酸盐相比，使用组氨酸作为缓冲剂时，铰链区的水解速率更低。

在某些情况下，液体制剂不够稳定，将蛋白质制成固态制剂是延长不稳定治疗性蛋白质保质期的一种替代方法。然而，在固态制剂的生产过程中，冷冻和干燥阶段产生的压力极易导致蛋白质受损，组氨酸在此过程中则可对蛋白质起到保护作用。因此，组氨酸是蛋白制剂冻干过程中使用最广泛的氨基酸，其通过形成玻璃状基质，将蛋白质分子分隔开，并限制蛋白质迁移，从而抑制蛋白质聚集和变性。

组氨酸还是一种抗氧化剂，能够清除溶液中的羟基自由基和单线态氧。微量金属离子，如铜和铁，通常以杂质的形式存在于药物制剂中，并能促进蛋白质的氧化。在蛋白质产品的加工和储存过程中，容器（例如不锈钢制造设备）也可能渗出具有氧化活性的金属。由于组氨酸能与这些离子形成强复合物，因此可作为抗氧化剂使用。将组氨酸用作辅料而也能为提高体内抗氧化保护提供一种安全有效的方法。

鉴于皮下注射的注射量有限（小于2 mL）以及剂量要求较高（几百毫克或更多），单克隆抗体有时会以较高浓度配制[3]。FDA批准的单克隆抗体制剂中，有三分之一是高蛋白浓度配制的（100 mg/mL或更高）。在这些获批的单克隆抗体中，最高蛋白浓度为200 mg/mL。由于胶体蛋白溶液中的蛋白质相互作用，单克隆抗体在高浓度制剂中表现出复杂的溶液特性，如高粘度、高聚集倾向和低稳定性。这些特性严重阻碍了用于皮下注射的高浓度单克隆抗体溶液的开发。此外，生物制药的高粘度使得制剂的最终超滤或透析步骤变的困难。

组氨酸已被证明可通过阳离子-π或π-π堆积相互作用与芳香族残基相互作用，并有助于降低粘度。当组氨酸作为不同浓度和不同pH值下的辅料使用时，mAb之间的分子间相互作用的大小和水动力学半径会受到影响。随着组氨酸浓度的增加，制剂的水动力学半径增大，在组氨酸浓度约为20 mM时达到峰值。组氨酸对水动力学半径的影响与溶液粘度和渗透压的变化有关。这些变化可能是氢键、芳香族（例如π堆积）和静电相互作用的结果。例如，在150 mg/mL的全人源ABX-IL8中，40 mM组氨酸可使粘度减半。因此，在弱酸性条件下，添加组氨酸是降低高浓度蛋白质溶液粘度的良好选择，组氨酸盐酸盐则是降低高浓度蛋白制剂粘度的首选盐。

溶解度不足是药物开发过程中常见的瓶颈，研究表明组氨酸可提高大豆蛋白的溶解度。大豆蛋白是一种常用的活性成分。无论盐浓度如何，加入组氨酸都能提高大豆蛋白的溶解度并降低其浊度（图3）[4]。

除却以上作为生物制剂配方中的组分之外，组氨酸还可用于色谱法纯化和分析单克隆抗体的洗脱液，在洗脱缓冲液中添加组氨酸可以提高单克隆抗体（mAbs）色谱纯化的杂质清除率。

参考文献：

[1] Robert G. Strickleya,, William J. Lambertb, A review of formulations of commercially available antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences.2021,2590-2608

[2] Katayama, et al. Effect of Buffer Species on the Thermally Induced Aggregation of Interferon-tau, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2006,95,6

[3] Shawn Shouye Wang,, Yifei (Susie) Yan and Kin Ho, US FDA-approved therapeutic antibodies with high-concentration formulation: summaries and perspectives，Antibody Therapeutics, 2021, 4, 262–273

[4] Wang, Y., Ma, T., Liu, C., Guo, F., Zhao, J. L-Histidine improves solubility and emulsifying properties of soy proteins under various ionic strengths. LWT ,2021,152, 112382.

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