本文文章来源于知乎《mRNA疫苗学习（下）》作者：卷毛哥的奇迹

 此前AVT小编给小伙伴们分享了一下具有更强免疫原性的mRNA疫苗的相关知识，mRNA疫苗需要你了解的知识可不只有那些哦，本期我们接着聊一聊mRNA疫苗的那些事！

 裸露的mRNA作为一种外源的核酸物质，进入体内后很容易免疫系统识别和被核酸酶降解，因此直接用裸露的mRNA作为疫苗其药理作用会大打折扣。为了提高mRNA疫苗的免疫效率，通常需要特殊递送系统的辅助。

 mRNA疫苗的给药方式

 mRNA疫苗的给药方式非常重要，会决定mRNA疫苗在体内的代谢，及目的抗原蛋白翻译的效率。例如，如果直接静脉注射未经任何处理的裸露mRNA，就会被血液中的核酸酶迅速降解。

 mRNA疫苗的给药也分为系统给药或者局部给药，根据抗原蛋白需要表达的位置来决定。如果是预防性疫苗，为了引起较强的免疫反应，通常用皮下和肌肉注射的局部给药。如果是治疗性mRNA疫苗通常通过腹腔或者静脉注射系统给药（这也包括下文述及的经DC细胞给药）。

 mRNA疫苗局部和系统给药

 经DC细胞给药

 mRNA疫苗另外一种非常重要的给药方式是通过DC细胞的转染进行给药，分为体内和体外两种DC细胞介导的方式。DC细胞是人体重要的抗原递呈细胞，其摄取抗原后可以诱导随后的免疫反应。在体外分离得到人体未成熟的DC细胞后，可以通过电穿孔技术转染mRNA，再把转染后的DC细胞过继入人体，产生被动免疫。但是通过体外DC转染的方式递送mRNA疫苗对技术的要求非常高，需要较长的体外培养时间，而且首先需要获取人体的DC细胞，在普通条件下难以实现。另外一个通过DC细胞给药的方式是淋巴内给药，mRNA被直接注射到淋巴内，这样mRNA就可以被淋巴内固有DC细胞获取，但是这种给药方式通常需要手术辅助，导致给药非常复杂且带了大量的风险。

 因此，经DC细胞给药的方式不适合预防性mRNA疫苗的给药，只有在一些治疗性mRNA疫苗的给药可能会被使用。

 mRNA经体外DC系统给药（癌症疫苗）

 mRNA的制剂系统

 为了保证mRNA疫苗的代谢稳定性和免疫活性，除了慎重评估给药方式外，还需要对mRNA疫苗的剂型进行特殊设计。mRNA进入体内后，首先面临周围组中（如：血液）核酸酶的降解，另外还需要穿过具有磷脂双分子层细胞膜。因此，mRNA疫苗的制剂系统需要保护mRNA不被核酸酶降解，而且还需要促进mRNA被细胞（APC、B细胞和T细胞等免疫细胞）摄取。

 已经有大量的mRNA制剂系统见诸报道，其中的很多已经进入临床试验阶段。这些制剂技术都是通过形成特殊的mRNA载体，来实现mRNA疫苗的递送，这些载体技术包括：鱼精蛋白载体技术、纳米颗粒脂质体载体技术、多聚体载体技术

 ·鱼精蛋白载体：

 鱼精蛋白是一种天然的阳离子蛋白，可以把带负电的mRNA分子络合成纳米级别的核酸颗粒，从而保护mRNA不被血清中的RNA酶降解；但是由于鱼精蛋白和mRNA的结合太紧密，因此采用这种制剂的mRNA疫苗的蛋白表达效率会受限，另外抗原的表达很大程度上也受到鱼精蛋白和mRNA比例的影响。德国CureVac公司开发的 RNActive平台成功解决了这个问题，通过RNActive平台得到的鱼精蛋白-mRNA复合物其中，鱼精蛋白作为TLR7/8拮抗剂可以诱发Th1细胞反应，mRNA可以表达目的蛋白诱导特异的免疫反应。

 另外，鱼精蛋白-mRNA组成的纳米级颗粒还可以进一步制备成脂质体，这种脂质体-鱼精蛋白-mRNA的制剂形式，兼有脂质体载体和鱼精蛋白载体的优势。

 鱼精蛋白制剂及鱼精蛋白-脂质体制剂示意图

 ·纳米颗粒脂质体（Lipid nanoparticles，LNPs）：

 LNP由四部分组成：阳离子脂质体、脂质体相连的聚乙二醇（增加半衰期），胆固醇（起到稳定制剂结构的作用）和磷脂（支持形成磷脂双分子层）。脂质体实际上是一种人工膜，可以将药物包封于类脂质双分子层内而形成微型泡囊体。

 LNP递送RNA的原理目前还不完全清楚，但是通常认为，LNP通过非共价亲和力和细胞膜结合并通过内吞作用被摄取，进入细胞后mRNA逃离内吞小泡，被释放到细胞质中表达靶蛋白。有意思的是，LNP还可以通过相反的胞吐作用被排出细胞外，这也是通过LNP进行mRNA给药需要注意的点。mRNA–LNP复合物的那器官为肝脏，进入体内后制剂和载脂蛋白E结合，随后通过受体介导的内吞作用，被肝脏细胞摄取；

 细胞内部脂质体mRNA疫苗的蛋白表

 ·多聚体载体

 多聚体载体技术在临床上的应用并没有脂质体类载体广，但是作为核酸药物的载体也表现了优异特性。多聚体载体通常为阳离子聚合物，阳离子聚合物可以通过静电作用跟带负电的mRNA形成多聚体，最终形成polyplexes或者micelleplexes；micelleplex由阳离子两亲性的共聚物生成，可以聚合形成胶束，通常表现出比polyplex更优异的稳定性，因为后者并不会形成胶束结构。在进行多聚体载体设计的时候需要额外考虑多聚体载体的分子量以及带电荷量，过大的载体分子和过多的载电量通常导致载体和mRNA分子结合太过稳定，而导致mRNA的表达效率过低。

 在众多多聚物载体材料中，聚乙烯亚胺（PEI）是最常用的阳离子聚合物，已经被广用作mRNA疫苗的载体；大分子量的聚乙烯亚胺更适合作为自我复制性mRNA疫苗的载体，因为自我复制性mRNA的分子量较且结构复杂，但是高分子量的聚乙烯亚胺同时会带来较高的毒性副作用，而且高分子量的聚乙烯亚胺对mRNA的结合非常稳定以至于无法顺利的在细胞质中释放mRNA；但是小分子量的PEI的转染能力有限；除了PEI外还有其他的分子被用来作为载体，例如：甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（PDMAEMA）。

 多聚体生成路线

 ·脂质体-多聚体纳米颗粒载体

 脂质体-多聚体纳米颗粒载体，顾名思义为脂质体载体技术和多聚体纳米颗粒技术的联合使用。在结构上，多聚体材料是载体的内核，而脂质或脂质-PEG包裹着内核形成脂质体。

 mRNA可以通过两种形式跟脂质体-多聚体纳米颗粒载体结合，第一种方式是结合在带正电荷的多聚体核心中，第二种方式是吸附在带正电荷的多聚体核心外侧。采用第二种方式结合的mRNA，可能更容易被释放。

 左：第一种方式；右：第二种方式

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