免疫疗法刺激固有的免疫系统对抗恶性细胞彻底改变了临床上的癌症治疗模式，已成为多种癌症的标准治疗方法。鉴于RNA可以通过抑制、增强、替代甚至编辑来调节基因表达，且mRNA和siRNA疗法在癌症免疫治疗中展现出具有巨大潜力，因此RNA可以应用于沉默免疫检查点基因、制造CAR-T细胞或者用作抗肿瘤疫苗等。然而，RNA疗法在癌症治疗中的临床应用受到RNA本身的不稳定性和各种生理屏障阻碍的限制。尽管存在这些挑战，核酸药物近年来获得迅速的发展，特别是脂质纳米颗粒（LNPs）在新型冠状病毒COVID-19 疫苗的应用进一步增强了人们对RNA治疗药物在其他疾病治疗应用的信心。

当下RNA介导的免疫疗法仍然面临着一些应用阻碍：1、LNPs主要在肝脏中积累并被肝细胞内化，从而限制了它们对其他器官和组织相关疾病的治疗效用；2、LNPs存在稳定性问题，LNP需要超低温储存（例如BNT162b2：-60和-80 ℃；mRNA-1273：-15和-25 ℃），这对RNA药物在全球运输、储存和流通是个极大的挑战。因此，迫切需要探索替代策略以开发用于RNA递送的临床适用平台技术。

2024年6月10日，华南理工大学生物医学科学与工程学院王均教授团队在材料科学领域国际刊物《Advance Functional Materials》上发表了题为“Long-Term Storage Stable Vesicle-Like Nanoparticles of Lipid and Polymer for siRNA and mRNA-Mediated Cancer Immunotherapy”的研究论交。第一作者：华南理工大学生物医学科学与工程学院的博士研究生陈超然，通讯作者：华南理工大学生物医学科学与工程学院许从飞教授、杨显珠教授与王均教授。研究团队通过使用临床批准的材料两亲性聚合物PEG5K-b-PLGA11K、DLin-MC3-DMA和DOTAP，成功开发了用于siRNA和mRNA介导的癌症免疫治疗的VNP递送平台。筛选后的VNP体系的转染效率与Lipofectamine RNAiMAX、LNP相当（图1g）。此外，因为RNA被有效封装在VNP的中空胶囊状内核中，即使在6个月的储存期（-20 ℃）后VNP也能保持优异的转染效率（图1hi）。

图1 VNP-siRNA储存稳定性研究

研究团队还建立了小鼠黑素瘤治疗模型和小鼠B16-OVA肿瘤预防模型，分别用以评估VNP介导siRNA和mRNA递送的体内免疫治疗效果。携带靶向PD-L1和CD47的siRNA的VNP能够在小鼠皮下黑素瘤治疗模型中增强肿瘤浸润性CD8+ T细胞比例并改善巨噬细胞吞噬作用，从而表现良好的免疫治疗效果（图2ab）；携带表达OVA抗原mRNA的VNP疫苗在小鼠B16-OVA肿瘤预防模型中产生了强大的免疫效应抗原，在多组织中都检测到了特异性CD8+ T细胞，可以有效抑制肿瘤生长（5/8小鼠出现完全缓解情况）和预防肿瘤肺转移（几乎100%）（图2cdefg）。本研究开发出了具有优异的转染效率以及较长的保质期的RNA递送平台技术VNP，为探索新型RNA递送系统提供了简便的策略。

图2 VNP-RNA在肿瘤中的治疗效果

附：VNP-siRNA的制备和表征

文中使用双乳液法制备VNPs-RNA，其中两亲性 mPEG-b-PLGA、可电离脂质和阳离子脂质溶解在有机相中，而siRNA作为模型 RNA 药物溶解在无 RNA 酶的水相中（图3a）。为了确定用于RNA递送的最佳VNP配方，初步研究了装载效率与 DOTAP 和 DLin-MC3-DMA 的质量比之间的关系。结果表明，siRNA 的装载效率高度依赖于 DOTAP 的含量，加入1.0 mg DOTAP 后达到98%，因此，配方中固定DOTAP 的质量为1.0 mg（图3b）。随后，研究了DLin-MC3-DMA 和 DOTAP 的质量比对 VNP-siRNA 性能的影响，结果表明，结构表明添加 DLin-MC3-DMA 对 siRNA 的装载效率影响微乎其微，粒径和 zeta 电位略有增加。此外，研究发现网格蛋白介导的内吞是 VNP-siRNA 的主要内化途径，内吞程度与 MC3/DOTAP 的质量比直接相关，DLin-MC3-DMA 含量增加会导致细胞通过网格蛋白介导的内吞摄取减少（图3j）。

对VNP进行体外筛选和体内生物分布研究。体外筛选结果表明，在不同肿瘤细胞类型中，MC3/DOTAP 质量比的增加有效地增强VNP对CD47 基因（在各种肿瘤细胞中高表达，可以逃避巨噬细胞的吞噬作用）的敲低效果，但不同细胞类型的最佳配方各不相同。体内生物分布研究结果表明，当 MC3/DOTAP 的质量比等于或小于1:1时，VNP 的肿瘤积累效果更好 (图3f)。综合考量，MC3/DOTAP 的质量比以1:1形成最终 VNP配方，用于后续涉及免疫检查点基因沉默的抗癌研究。

图3 VNP-siRNA的制备和表征

注：f：（I）Heart,（II）lung,（III）liver,（IV）kidney,（V）spleen,（VI）tumor.